New England Biolabsin uudet proteiinien leimaustuotteet

New England Biolabsin kuvantamistuotevalikoima on laajentunut uuteen proteiinien leimausteknologiaan perustuvilla tuotteilla, joilla voidaan tutkia proteiinien toimintaa ja lokalisaatiota elävissä ja fiksatuissa soluissa. SNAP-tag-teknologia mahdollistaa erilaisten toiminnallisten ryhmien liittämisen yhdellä ja samalla geenikonstruktilla tehtyyn fuusioproteiiniin. Teknologia perustuu erilaisiin proteiiniin fuusioitaviin tageihin, joihin voidaan liittää kovalenttisesti melkein mitä vain: esim. fluoroforeja, biotiinia tai partikkeleita. Tämän ansiosta ei tarvitse tehdä uutta fuusioproteiinia, jos halutaan vaihtaa kokeissa käytettävää fluoroforia.

SNAP- ja CLIP-tagit mahdollistavat spesifisen kovalenttisen kohdeproteiinin leimauksen, kun taas MCP- ja ACP-tageilla proteiini voidaan leimata entsymaattisesti.

SNAP- ja CLIP-tagit

SNAP-tag on muokattu versio AGT-entsyymistä (alkylguanine-DNA-alkyltransferase), joka osallistuu DNA:n korjaamiseen. Entsyymiä on modifioitu siten, että se on kooltaan vain 20 kD ja toimii nopeammin. Entsyymin affiniteetti DNA:han on myös poistettu. SNAP-tag muodostaa stabiilin kovalenttisen tioeetteri-sidoksen fluoroforin tai muun bentsyyliguaniinia sisältävän substraatin kanssa. SNAP-tagin substraatteja löytyy laaja valikoima näkyvän valon aallonpituudesta IR-alueelle asti.

CLIP-tag on modifioitu SNAP-tag, joka on muokattu reagoimaan bentsyylisytosiinijohdannaisten kanssa. Samassa kokeessa voidaan käyttää sekä CLIP- että SNAP-fuusioproteiineja. CLIP-tagin substraatteja löytyy 360 nm aallonpituusalueelta lähi-IR-alueelle.

SNAP- tai CLIP-tagin mekanismi: Proteiiniin fuusioitu SNAP- tai CLIP-tag leimautuu "X"-leimalla. Samalla vapautuu guaniinia tai sytosiinia. Klikkaamalla näet kuvan isompana.

ACP- ja MCP-tagit

ACP- ja MCP-tagit ovat pieniä polypeptidejä (8 kD), jotka pohjautuvat asyylin siirtäjäproteiiniin (acyl carrier protein). Niiden leimaus vaatii reaktioseokseen ACP- tai SFP-syntaasi entsyymin. ACP- tai MCP-tageilla voidaan värjätä solun pintarakenteita, koska niiden substraatit (CoA-konjugaatteja) eivät läpäise solukalvoa. Lisäksi nämä tagit ovat niin pieniä, että niillä voidaan värjätä rakenteita, joiden värjääminen esim. GFP-fuusiona ei olisi mahdollista. Tällä hetkellä NEBin valikoima sisältää seuraavat substraatit: biotiini ja kolme CoA-substraattia ( 488 nm, 547 nm ja 647 nm).

ACP-tagin mekanismi: Kohdeproteiiniin (sininen) fuusioitu ACP-tag (punainen) leimautuu sopivan syntaasin läsnäollessa.

Tagien käyttö

SNAP- ja CLIP-tageilla voidaan leimata solun sisäisiä tai solukalvon pinnassa olevia rakenteita, ja kohteen mukaan niille valitaan joko solukalvon läpäisevä tai läpäisemätön substraatti. NEBin kokeiden perusteella substraatit eivät ole leimauspitoisuutena (alle 20 µM liuos) soluille myrkyllisiä. Soluja voidaan inkuboida useimpien substraattien kanssa 24 h ilman toksisia vaikutuksia.

SNAP- ja CLIP-fuusioidut proteiinit voidaan visualisoida SDS-PAGE-geelillä VISTA green- ja blue-väreillä.

SNAP-tagia on käytetty myös bakteerien värjäämiseen , mutta fuusioproteiinien liukoisuus on tietysti riippuvainen myös käytetystä fuusioproteiinipartnerista. Tagien käytön alkuun pääsee helpoiten valmiilla Starter-paketilla, joka sisältää vektorin, kontrollivektorin, kaksi erilaista substraattia sekä blokkausaineen.

Starter-kitit

Lisätietoja

NEB Cellular Imaging and Analysis
Lisätietoa SNAP-tag-teknologiasta

Yhteyshenkilö

Marika Gardemeister
puh: 09 2472 3251
faksi: 09 2472 3200
marika.gardemeister@finnzymes.fi